Crosslinking e lise
- A uma cultura de 20 ml de bactérias, adicione 550 µl de 37% formaldeído (alto grau de pureza). Incube por 10 min em T.A.
- Adicione 1 ml de 10X glicina (100 mg/ml glicina)
- Misture e incube por 5 min em T.A.
- Centrifugue por 10 min a 5000 rpm
- Despreze o sobrenadante e ressupenda o pellet em 10 ml de PBS gelado
- Repita por mais 2X a lavagem em PBS
- Ressuspenda o pellet em 500 µl de tampão de lise contendo 10 mg/ml lisozima. Adicione 5 µl do cocktail de inibidores de protease
- Vortex e incube por 10 min em T.A.
- Adicione 540 µl de tampão RIPA 2X (100 mM Tris pH 8.0; 300 mM NaCl; 2% Nonidet P40; 1% Deoxicolato de sódio; 0.2% SDS)
- Sonicar. Para verificar o tamanho dos fragmentos de DNA, retire amostras (50 µl) nos intervalos de sonicação.
- Centrifugue as amostras sonicadas por 30 min a velocidade máxima
- Incube durante a noite a 65°C
- Corra as amostras um gel de agarose
Tampão de lise (50 mL)
10 mM Tris pH 8.0 50 mM NaCl 10 mM EDTA 20% sacarose para um volume final de 50 ml Antes de usar adicione lisozima para uma conc. final de 10 mg/ml