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Adicione em um microtubo:
50 µg/ml do vetor (circular ou com pontas cegas) |
1 µl |
25 µg/ml de fragmento de PCR |
8 µl |
10X Tampão KGB ou Tango (Fermentas) |
2 µl |
10 mM ATP |
1 µl |
2 mM dNTPs |
1 µl |
Enzima de Restrição (Ex: SmaI, EcoRV) |
2 unidades |
T4 DNA polimerase |
1 unidade |
T4 DNA ligase |
3 unidades |
H2O |
ajustar para 20 µl |
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Incube por 4 h a 22oC
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Extraia com clorofórmio e precipite com EtOH
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Resuspenda em 6 µl de H2O e eletropore metade do volume.