- Cultive 10 ml de bactérias overnight ou até atingir a fase estacionária
- Meça a turbidez da cultura
- Centrifugue a cultura e ressuspenda o pellet em 4 ml de solução A
- Sonique as células por 30 s (5X) ou de acordo com instruções do fabricante do sonicador
- Centrifugue o extrato de células por 10 min a 13000 rpm em 4 oC
- Transfira o sobrenadante a um novo tubo e aqueça por 15 min a 55 oC (para inativar a HP I)
- Determine a concentração de proteínas utilizando o método de Bradford ou Lowry
- Dilua H2O2 na hora em salina para uma concentração final de 59 mM
- Em uma cubeta de quartzo adicione: 0.5 ml de salina e 40 µg de proteínas, misturar bem e zerar o espectrofotometro em A240
- Adicione 0.5 ml de H2O2 , misture e meça a cinética de diminuição da absorbância em A240
- Calcule a atividade específica de catalase de acordo coma fórmula:
1000 X A240/min (inclinação da reta)/43.6 X mg proteína na cubeta
Solução A (25 ml): H2O Salina 80% glicerol 20 mM PMSF 0.5 M EDTA
20.4 ml
1.25 ml
3.1 ml
31 µl
250 µl