Clonagem de Produtos de PCR em vetores de ponta cega

  1. Adicione em um microtubo:

50 µg/ml do vetor (circular ou com pontas cegas)

1 µl

25 µg/ml de fragmento de PCR

8 µl

10X Tampão KGB ou Tango (Fermentas)

2 µl

10 mM ATP

1 µl

2 mM dNTPs

1 µl

Enzima de Restrição (Ex: SmaI, EcoRV)

2 unidades

T4 DNA polimerase

1 unidade

T4 DNA ligase

3 unidades

H2O

ajustar para 20 µl

  1. Incube por 4 h a 22oC

  2. Extraia com clorofórmio e precipite com EtOH

  3. Resuspenda em 6 µl de H2O e eletropore metade do volume.