1. Bloqueio da membrana: Mergulhe a membrana em uma solução (10 ml) PBS-T contendo 5% de Molico por 1 hora a R.T. ou O.N. a 4°C
2. Anticorpo Primário: Dilua o anticorpo primário (normalmente 1000X) em PBS-T e incube por 1-2 h com leve agitação em R.T. ou overnight a 4°C
3. Lavagem: Lave 6 vezes com PBS-T por 5 min cada lavagem

4. Anticorpo Secundário: Dilua o anticorpo secundário (10,000X- 100,000X) e incube a membrana por 1-2 h a temperatura ambiente
5. Lave com PBS-T 6 vezes com PBS-T por 5 min cada lavagem
6. Detecção: Misture volumes iguais de solução de detecção 1 e 2 (o substrato é estável por 24 h)
7. Incube a membrana na solução de detecção ( 0.125 ml/cm2) por pelo menos 5 min com leve agitação
8. Remova a membrana, retire o excesso da mistura de detecção e envolva a membrana em filme PVC. Elimine todas as bolhas de ar. Exponha um filme de raio-X por 1 minuto e revele imediatamente.
9. Se houver necessidade exponha novos filmes.

PBS (pH 7.4)

O pH da solução de PBS 10X é 6.8, mas muda para 7.4 quando diluído para 1X PBS
PBS-T
Adicione Tween-20 a uma concentração final de 0.05%